3.1 簡(jiǎn)介
食品和飼料由包含生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)所必需氨基酸的化合物組成。分析氨基酸含量對(duì)于確保合適的營(yíng)養(yǎng)非常重要。但是，這些產(chǎn)品是通過批量工藝生產(chǎn)的。與藥物生產(chǎn)一樣，批量工藝在生產(chǎn)運(yùn)行過程中，產(chǎn)出可能會(huì)有所不同。因此，必須考慮代表性樣品的構(gòu)成因素。通常需要采用二次抽樣策略。這些產(chǎn)品的氨基酸分析需要采用多種方法，以便正確分析樣品的總蛋白質(zhì)組成。由于食品和飼料是批量生產(chǎn)的，且其中包含非蛋白質(zhì)成分，因此建議使用液相水解方法。
注：含硫氨基酸 - 半胱氨酸和蛋氨酸，以及色氨酸在標(biāo)準(zhǔn)酸水解中不穩(wěn)定。可以采用替代方法來有效分析這些氨基酸。
本節(jié)介紹了三種不同的水解方法：
酸水解 - 測(cè)定總蛋白質(zhì)含量和組成
過甲酸氧化 - 測(cè)量含硫氨基酸 - 半胱氨酸和蛋氨酸
堿水解 - 評(píng)估色氨酸回收率
3.2 食品和飼料的酸水解
分析結(jié)合在蛋白質(zhì)中的氨基酸時(shí)，必須破壞肽鍵，釋放氨基酸以進(jìn)行分析（圖1）。對(duì)于要水解的飼料蛋白質(zhì)樣品，應(yīng)考慮樣品材料的pH值和存在的固體。如之前的小節(jié)所述，水解的速率或程度因蛋白質(zhì)中存在的氨基酸而異。對(duì)于食品材料中結(jié)合的蛋白質(zhì)而言尤其如此。和其他水解方法一樣，選擇參數(shù)的必須基于嚴(yán)謹(jǐn)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
在飼料分析中，必須牢記樣品制備的三個(gè)因素：
樣品處理
水解的樣品量
用于水解的酸體積
3.2.1 樣品處理
飼料谷物及類似的樣品通常不均勻。為了使這類樣品盡可能地保持均勻，應(yīng)將樣品研磨成細(xì)粉。對(duì)于高脂樣品，可以在最終研磨前通過標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行脫脂處理。細(xì)粉可有效水解飼料蛋白質(zhì)。AOAC方法（4.1.11，994.12b，J.AOAC Int.88，2005，飼料的氨基酸分析）中要求將測(cè)試樣品研磨至能夠通過0.25 mm或60目篩（粒徑250 µm）的程度。
3.2.2 樣品量
對(duì)于飼料的氨基酸分析，AOAC方法建議使用以下計(jì)算來確定飼料分析中使用的樣品量。
要計(jì)算要使用的待測(cè)樣品的大致量，公式如下：
Ws = 1000/Ns
其中，Ns = 待測(cè)樣品的氮含量(%)，Ws = 與10 mg氮含量相當(dāng)?shù)拇郎y(cè)材料的重量(mg)。
一般來說，對(duì)于每個(gè)分析的樣品，所用材料的含量范圍約在100–1000 mg內(nèi)。
3.2.3 酸體積
如前所述，有效水解蛋白質(zhì)樣品需要大量過量的酸。飼料也不例外。但是，與第2.1.2節(jié)中討論的過量100倍不同，根據(jù)AOAC方法994.12中的說明，添加的酸重量與樣品重量的比率范圍應(yīng)為50–500倍。由于該范圍較大，以及飼料中存在大量非蛋白質(zhì)顆粒物質(zhì)，因此要先對(duì)范圍進(jìn)行仔細(xì)地探索研究，然后才能將范圍應(yīng)用于常規(guī)飼料分析。
3.2.4 內(nèi)標(biāo)
使用內(nèi)標(biāo)(IS)可很好地補(bǔ)償樣品中各氨基酸可能發(fā)生的水解。沃特世建議在UPLC上使用正纈氨酸(Nva)作為AccQ•Tag Ultra的內(nèi)標(biāo)，在HPLC上使用α-氨基丁酸(AABA)或正亮氨酸作為AccQ•Tag的內(nèi)標(biāo)。AOAC方法994.12中推薦使用正亮氨酸作為飼料分析的內(nèi)標(biāo)。請(qǐng)謹(jǐn)慎選擇內(nèi)標(biāo)，確保色譜中氨基酸峰之間可以獲得所需的分離度。
3.2.5 AOAC 994.12 - 飼料中的氨基酸
文獻(xiàn)報(bào)道了多種適用于飼料中氨基酸分析的方法。此處介紹的方法改編自AOAC方法994.12“飼料中的氨基酸"。
3.2.5.1 設(shè)備和玻璃器皿：
分析天平（可讀性：± 0.1 mg）
上皿式天平
溶劑瓶，50 mL；聚乙烯
可使用水解試管、燒瓶
可使用消解器、加熱罩或水浴
過濾器裝置，0.22 µm（Millex GS、Millipore均適用）
pH計(jì)，經(jīng)pH 2.0、4.0和7.0的緩沖液校正
回流冷凝器
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀
玻璃燒杯（250 mL和1000 mL）
錐形瓶(150 mL)
圓底蒸發(fā)瓶(1000 mL)
量筒（100 mL、500 mL和1000 mL）
容量瓶(1000 mL)
移液管（10 mL和20 mL）
燒結(jié)玻璃過濾器（孔隙10–15 µm）
注射器
3.2.5.2 試劑
DL-正亮氨酸（晶體）
濃鹽酸
氫氧化鈉，30%溶液(30 g/100 mL)
苯酚（晶體）
硫二甘醇（98%溶液）
二水合檸檬酸三鈉
pH緩沖液（pH 2.0、4.0和7.0）
3.2.5.3 溶液制備
檸檬酸鈉緩沖液 - pH 2.20
稱取19.60 g二水合檸檬酸三鈉，放入1000 mL燒杯中。
將其溶于約800 mL水中。
攪拌時(shí)，加入10 mL 98%硫二甘醇溶液和15 mL HCl。
將溶液定量轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶中，用水定容。
使用燒結(jié)玻璃過濾器過濾緩沖液。
用HCl或2 M NaOH將pH調(diào)節(jié)至2.20。
6 M HCl-苯酚溶液
稱取1 g苯酚晶體，放入已去皮重的1000 mL燒杯中。
將晶體溶于500 mL水中。攪拌時(shí)，緩慢加入500 mL HCl。
鹽酸溶液 - 1 M
將約800 mL水倒入1000 mL容量瓶中。
使用移液管加入83.3 mL HCl。
用水定容并充分混合。
鹽酸溶液 - 0.1 M
將約800 mL水倒入1000 mL容量瓶中。
使用移液管加入100 mL 1 M HCl。
用水定容并充分混合。
氫氧化鈉溶液(2 M NaOH)
稱取80.0 g NaOH，放入已去皮重的1000 mL燒杯中。
在燒杯中，將顆粒緩慢溶于約600 mL水中。
冷卻溶液并將其定量轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶中。
用水定容并充分混合。
內(nèi)標(biāo)溶液
準(zhǔn)確稱取195–200 mg DL-正亮氨酸晶體，放入已去皮重的150 mL錐形瓶中。
用100 mL 1 M HCl溶解晶體。
將溶液定量轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶中，用水定容。
3.2.5.4 水解步驟
準(zhǔn)確稱取100–1000 mg研磨粉碎的待測(cè)樣品（精確至0.1 mg；相當(dāng)于氮含量約10 mg），放入帶標(biāo)記的水解試管中。使用之前小節(jié)中所述的計(jì)算方法確定要使用的實(shí)際樣品量。
將50 mL 6 M HCl-苯酚溶液加入已稱重的樣品中，稍稍攪拌。向溶液中加入2–3塊沸石。
在通風(fēng)櫥中，使用平衡至110–120 °C溫度的加熱器或水浴，回流水解24 h。
將水解試管從加熱裝置中取出，等待試管冷卻至室溫。
使用移液管，將20 mL正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液加入各待測(cè)溶液中。搖動(dòng)燒瓶，將溶液混合。
使用燒結(jié)玻璃過濾器將水解產(chǎn)物過濾到帶標(biāo)記的1000 mL的圓底蒸發(fā)瓶中。
將蒸發(fā)瓶連接至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在60 °C下蒸干。
加入約20 mL水清洗，然后重復(fù)蒸發(fā)。重復(fù)清洗和蒸發(fā)步驟兩次。
從蒸發(fā)儀中取出蒸發(fā)瓶。
將50 mL檸檬酸鈉緩沖液加入蒸發(fā)后的水解產(chǎn)物中，充分混合，然后轉(zhuǎn)移至帶標(biāo)記的50 mL聚乙烯瓶中。
現(xiàn)在可對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理。
3.3 使用過甲酸氧化法測(cè)定半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸
半胱氨酸和蛋氨酸是飼料材料分析中的關(guān)鍵氨基酸；兩者都可限制食用飼料動(dòng)物的生長(zhǎng)。由于標(biāo)準(zhǔn)酸水解條件不適用于這兩種特定氨基酸，因此通常替代使用過甲酸進(jìn)行氧化。該方法可將半胱氨酸和胱氨酸轉(zhuǎn)化為三聚氰酸，將蛋氨酸轉(zhuǎn)化為蛋氨酸砜（圖3）。然后可對(duì)樣品進(jìn)行有效的酸水解和衍生化處理。
文獻(xiàn)中報(bào)道了多種形式的過甲酸氧化。盡管總體過程相似，但具體情況有所不同。本指南中介紹了可用作可能起點(diǎn)的兩種流程。第一種方法來自AOAC 994.12。第二種方法基于MacDonald等人(1985)的報(bào)道，為其方法的替代方法。在選擇具體方法之前，必須仔細(xì)地評(píng)估和優(yōu)化。
3.3.1 過甲酸氧化，方法1，AOAC 994.12
3.3.1.1 設(shè)備和玻璃器皿
分析天平（可讀性：± 0.1 mg）
上皿式天平
溶劑瓶，50 mL；聚乙烯
可使用水解試管、燒瓶
可使用消解器、加熱罩或水浴
過濾器裝置，0.22 µm（Millex GS、Millipore均適用）
pH計(jì)，經(jīng)pH 2.0、4.0和7.0的緩沖液校正
回流冷凝器
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀
玻璃燒杯（250 mL和1000 mL）
錐形瓶(150 mL)
圓底蒸發(fā)瓶(1000 mL)
量筒（100 mL、500 mL和1000 mL）
容量瓶(1000 mL)
移液管（10 mL和20 mL）
燒結(jié)玻璃過濾器（孔隙10–15 µm）
冰浴
注射器
3.3.1.2 試劑
甲酸(88%)
過氧化氫(30%)
焦亞硫酸鈉
DL-正亮氨酸（晶體）
濃鹽酸
氫氧化鈉，30%溶液(30 g/100 mL)
苯酚（晶體）
硫二甘醇（98%溶液）
二水合檸檬酸三鈉
pH緩沖液（pH 2.0、4.0和7.0）
3.3.1.3 溶液制備
檸檬酸鈉緩沖液 - pH 2.20
稱取19.60 g二水合檸檬酸三鈉，放入1000 mL燒杯中。
將其溶于約800 mL水中。
攪拌時(shí)，加入10 mL 98%硫二甘醇溶液和15 mL HCl。
將溶液定量轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶中，用水定容。
使用燒結(jié)玻璃過濾器過濾緩沖液。
用HCl或2 M NaOH將pH調(diào)節(jié)至2.20。
6 M HCl-苯酚溶液
稱取1 g苯酚晶體，放入已去皮重的1000 mL燒杯中。
將晶體溶于500 mL水中。攪拌時(shí)，緩慢加入500 mL HCl。
鹽酸溶液 - 1 M
將約800 mL的水倒入1000 mL容量瓶中。
使用移液管加入83.3 mL HCl。
用水定容并充分混合。
鹽酸溶液 - 0.1 M
將約800 mL的水倒入1000 mL容量瓶中。
使用移液管加入100 mL 1 M HCl。
用水定容并充分混合。
氫氧化鈉溶液(2 M NaOH)
稱取80.0 g NaOH，放入已去皮重的1000 mL燒杯中。
在燒杯中，將顆粒緩慢溶于約600 mL水中。
冷卻溶液并將其定量轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶中。
用水定容并充分混合。
內(nèi)標(biāo)溶液
準(zhǔn)確稱取195–200 mg DL-正亮氨酸晶體，放入已去皮重的150 mL錐形瓶中。
用100 mL 1 M HCl溶解晶體。將溶液定量轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶中，用水定容。
過甲酸試劑
在通風(fēng)櫥中制備。稱取25 mg苯酚晶體，放入25 mL試管中。
使用微量移液管加入0.5 mL 30% 過氧化氫。
加入4.5 mL 88%甲酸溶液。
用塞子塞緊試管，在室溫下等待混合物靜置30 min。
30 min后，將試管置于冰浴中，等待過甲酸混合物冷卻15 min。
請(qǐng)?jiān)谂R使用前制備試劑。
3.3.1.4 過甲酸氧化
準(zhǔn)確稱取100–1000 mg研磨粉碎的待測(cè)樣品（精確至0.1 mg；相當(dāng)于氮含量約10 mg），放入帶標(biāo)記的水解試管中。使用上述計(jì)算方法確定要使用的實(shí)際樣品量。
將磁力攪拌器放入各試管中，并將水解試管置于冰浴(0 °C)中。
等待過甲酸和待測(cè)樣品冷卻至少15 min后，向每個(gè)水解試管中加入5 mL過甲酸試劑；塞緊所有試管或蓋上蓋子，攪拌15 min。
將水解試管放回冰浴中，等待樣品氧化16 h。
取下玻璃塞，加入約0.84 g焦亞硫酸鈉以分解過甲酸。攪拌15 min，釋放SO2。
現(xiàn)在樣品可進(jìn)入酸水解階段。
3.3.1.5 水解步驟
將50 mL 6 N HCl-苯酚溶液加入已稱重的樣品中，稍稍攪拌。向溶液中加入2–3塊沸石。
在通風(fēng)櫥中，使用平衡至110–120 °C溫度的加熱器或水浴，回流水解24 h。
將水解試管從加熱裝置中取出，等待試管冷卻至室溫。
使用移液管，將20 mL正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液加入各待測(cè)溶液中。搖動(dòng)燒瓶，將溶液混合。
繼續(xù)下面的步驟(a-d)或(e-g)。
使用燒結(jié)玻璃過濾器將水解產(chǎn)物過濾到帶標(biāo)記的1000 mL圓底蒸發(fā)瓶中。
將蒸發(fā)瓶連接至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，并在40 °C真空條件下蒸發(fā)至0.5 mL，注：請(qǐng)勿將溶液蒸干。
從蒸發(fā)儀中取出蒸發(fā)瓶。
將50 mL檸檬酸鈉緩沖液加入蒸發(fā)后的水解產(chǎn)物中，充分混合，然后轉(zhuǎn)移至帶標(biāo)記的50 mL聚乙烯瓶中。
使用燒結(jié)玻璃過濾器將水解產(chǎn)物過濾到250 mL真空燒瓶中，然后將濾液轉(zhuǎn)移到250 mL燒杯中。
將燒杯置于冰浴中。
在攪拌的同時(shí)，使用約40 mL 7.5 M NaOH部分中和水解產(chǎn)物。（注：溫度不得超過40 °C。）使用2 M NaOH將pH調(diào)節(jié)至2.20。
6.現(xiàn)在可對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理。
3.3.2 基于MacDonald等人(1985)報(bào)道的方法，進(jìn)行胱氨酸和蛋氨酸的過甲酸氧化和酸水解（方法2）
注：文獻(xiàn)中報(bào)道了許多有關(guān)該分析的不同參考資料，其中關(guān)于過甲酸和溴化氫的含量或蒸發(fā)溫度未達(dá)成一致。更改含量和/或溫度將影響步驟7中的蒸發(fā)時(shí)間。
3.3.2.1 材料
25 × 150 mm帶蓋試管
冰和冰浴
移液管
真空蒸發(fā)儀
潔凈的氮?dú)庠?/span>
恒溫箱或加熱器
玻璃量具
過甲酸
過氧化氫
甲酸
超純水
HBr溶液，48%（重量比）
3.3.2.2 過甲酸試劑
將1體積的30%過氧化氫加入9體積的88%甲酸中。
將混合物靜置1 h，頻繁搖動(dòng)。
將混合物置于冰浴中30 min，然后立即使用。
3.3.2.3 步驟
稱取相當(dāng)于約20 mg蛋白質(zhì)（精確至mg）的樣品，放入25 × 150 mm試管中。
將樣品置于冰浴中30 min。
向樣品中加入10 mL冷過甲酸，輕輕搖動(dòng)，然后使用Teflon墊片蓋密封。
將樣品（仍處于大量冰中）置于冰箱中(0 °C)冷藏過夜(16 h)。
16 h后，將樣品仍保存在0 °C條件下，加入3滴辛醇，然后加入3 mL冷卻的48% HBr，緩慢搖動(dòng)樣品。請(qǐng)?jiān)谕L(fēng)櫥中完成該步驟。將樣品在0 °C下靜置30 min。
使用真空蒸發(fā)儀在37 °C下將樣品蒸干。該過程需要1–2 h。
向試管中加入5 mL的6 N HCl。使用氮?dú)獯祾?/span>30 s，然后立即封蓋。
將樣品置于110 °C恒溫箱中加熱24 h。
將樣品從恒溫箱中取出，等待樣品冷卻。
加入10 mL工作內(nèi)標(biāo)(5.0 µmol/mL)，并充分混勻。注：應(yīng)計(jì)算所用內(nèi)標(biāo)的實(shí)際濃度，以使進(jìn)樣至儀器的樣品量相同。
將樣品定量轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，用HPLC級(jí)水沖洗樣品試管，并用沖洗液定容。
使用0.45 µm樣品過濾器過濾步驟12中的樣品約1 mL。如果沒有立即進(jìn)行衍生化處理，請(qǐng)將加蓋的樣品儲(chǔ)存于冰箱中。注：離心可代替該過濾步驟。離心以產(chǎn)生澄清的上清液。
3.4 通過堿水解分析飼料中的色氨酸
在標(biāo)準(zhǔn)酸水解條件下，色氨酸(Trp)不穩(wěn)定，無法進(jìn)行有效分析。因此，將堿水解用作飼料中該氨基酸釋放和分析的替代方法。此方法使用4.2 M NaOH水解蛋白質(zhì)。它的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，完成后無需進(jìn)行衍生化步驟。只需進(jìn)行UV檢測(cè)(280 nm)的儀器分析即可。
此處介紹的步驟改編自AOAC方法988.15“食品以及食品和飼料成分中的色氨酸“。
3.4.1 設(shè)備和材料
改良微量凱氏燒瓶（Kjeldahl flask，可從Ace Glass, Inc.訂購(gòu)）- 25 mL微量凱氏燒瓶，內(nèi)徑12 mm，頸長(zhǎng)15 cm。頸部收縮至內(nèi)徑約6 mm，在燒瓶球部上方5 cm。
真空泵
膜式過濾器和0.45 µm過濾器
干冰
水浴
水浴用乙醇
移液管和玻璃器皿
pH計(jì)
3.4.2 試劑
經(jīng)Milli-Q系統(tǒng)(Millipore Corp.)純化的水，或同等級(jí)水
4.2 M NaOH
1-辛醇
pH 4.25檸檬酸鈉緩沖溶液
HCl
色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液
儲(chǔ)備液 - 1 mg/mL。將250 mg L-色氨酸溶于100 mL水中（其中添加有六滴HCl）中。用水稀釋至250 mL。
工作溶液I - 0.1 mg/mL。用水將10 mL儲(chǔ)備液稀釋至100 mL。
工作溶液II - 0.04 mg/mL。用水將4 mL儲(chǔ)備液稀釋至100 mL。
不使用時(shí)，請(qǐng)冷藏標(biāo)準(zhǔn)品溶液。請(qǐng)每月制備新鮮溶液。
3.4.3 制備待測(cè)樣品
在配備1 mm篩網(wǎng)的離心式磨機(jī)中研磨實(shí)驗(yàn)室樣品；充分混合。
稱取包含100 mg蛋白質(zhì)的待測(cè)樣品，放入改良微量凱氏燒瓶中。
對(duì)于脂質(zhì)含量 > 5%的待測(cè)樣品：
在燒瓶中，將10 mL石油醚加到已稱重的待測(cè)樣品中。
輕輕搖動(dòng)混合，并超聲處理20 min。靜置。必要時(shí)離心。
盡可能多地吸出石油醚，小心地避免吸出任何固體。
在溫和的氮?dú)饬飨抡舭l(fā)剩余的石油醚。繼續(xù)進(jìn)行水解。
對(duì)于脂質(zhì)含量 < 5%的待測(cè)樣品：繼續(xù)進(jìn)行水解。
3.4.4 堿水解步驟
通過氮?dú)夤呐?/span>10 min，從4.2 M NaOH中除去氣泡。
將10 mL排除氣泡的4.2 M NaOH加入各燒瓶中。
加入三滴1-辛醇。
立即在干冰/乙醇浴中冷凍處理后的溶液。然后從干冰/乙醇浴中取出燒瓶并且抽真空至10 mm。
關(guān)閉真空并密封燒瓶。
將密封的燒瓶置于室溫下裝有水的燒杯中，直至待測(cè)溶液融化。
將燒瓶置于110 °C恒溫箱中加熱20 h。
等待燒瓶冷卻至室溫。
用1 mL pH 4.25的檸檬酸鈉緩沖溶液沖洗燒瓶頸部，將沖洗液收集到燒杯中。
將水解產(chǎn)物定量轉(zhuǎn)移至同一50 mL燒杯中，用兩份pH 4.25的檸檬酸鈉緩沖液沖洗燒瓶。
用3.5 mL HCl中和溶液并用力攪拌。將pH調(diào)節(jié)至4.25 ± 0.05。
將溶液定量轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用水定容。
將溶液倒入40 mL離心管中，并在1150 G下離心20 min。
使用玻璃纖維濾紙(Whatman GF/A)過濾上清液。
將濾液轉(zhuǎn)移到離心管中，并在23,000 G下離心10 min。
注：此時(shí)可以取上清液等分試樣進(jìn)行UV (289 nm)分析，無需衍生化處理。
